4 хл какой это размер: Как выбрать размер. Мужская и женская размерные таблицы

Инфографика

Справочник покупателя

Что такое 4-канальный усилитель?

4-канальный усилитель – это устройство, которое принимает электрический сигнал и, как следует из названия, усиливает этот сигнал.Затем он отправляет этот сигнал по своим каналам для приема динамиками, будь то динамики, специальные высокочастотные динамики или сабвуферы. Как следует из названия, 4-канальный усилитель выдает одинаковую мощность для всех 4-х каналов.

4-канальный усилитель против 2-канального усилителя

4-канальный усилитель обычно используется для питания либо 4 динамиков – часто 6×9 + передние динамики, либо 2 передних динамиков и сабвуфера с 2-мя соединенными мостами.

Конечно, если вы хотите запитать все четыре динамика, а также сабвуфер, вам потребуется либо 5-канальный усилитель, либо, что более вероятно, приобрести моноблок, который является отдельным усилителем для сабвуфера.

При мостовом соединении вы можете подключить динамики параллельно, но сопротивление динамиков может уменьшиться, поэтому вам нужно обратить внимание на коэффициент импеданса усилителя.

Конечно, 2 стандартных динамика 6 × 9 вполне можно подключить к 2-канальному усилителю, но 2-канальные усилители на самом деле не предназначены для этой цели.

Вместо простого питания двух стандартных динамиков, 2-канальный усилитель часто используется для питания одного или двух сабвуферов вместо .

Следует отметить, что 2-канальный усилитель обычно выдает больше среднеквадратичной мощности через каждый из своих каналов, чем 4-канальный. Эта дополнительная мощность служит истинной цели 2-канального усилителя: усилить басы.

Имейте в виду, что это не редкость для усилителя, состоящего из 4-канального и 2-канального усилителя. Первый питает динамики, а второй – сабвуфер или сабвуферы.И в этом случае ваши автомобильные аудиоколонки будут обладать удивительной мощностью.

Вт на канал и импеданс

Эти два значения мощности будут определять мощность, которую ваш усилитель может подавать на акустическую систему. Однако пиковая мощность обычно используется как маркетинговый ход, а RMS является более важным из двух .

RMS-мощность относится к мощности, которая может передаваться с постоянной скоростью по каждому каналу, в то время как пиковая мощность относится больше к максимальной мощности, которую усилитель может выдать за один цикл.

Для RMS-мощности часто бывает два или более разных значения в зависимости от импеданса динамика. Как правило, чем выше импеданс, тем ниже среднеквадратичная мощность на канал. Однако есть несколько усилителей, которые обеспечивают одинаковую мощность на канал, независимо от импеданса.

Хотя импеданс не обязательно является качеством, относящимся исключительно к усилителю, он по-прежнему является одним из наиболее важных аспектов вашей акустической системы для обеспечения наилучшего качества звука.

У ваших динамиков будет свой собственный рейтинг импеданса, и каким бы он ни был, усилитель должен иметь возможность передавать мощность через свои каналы на этом уровне Ом. Невозможно подключить меньшее сопротивление динамика, чем сопротивление усилителя.

Например:

А – мин. 4 Ом на канал

Динамики – 2 Ом (нельзя)

Динамики – 8 Ом (нормально, но требуется больше мощности)

Посмотрите, насколько велик предохранитель усилителя

Размер предохранителя усилителя будет определять, сможет ли усилитель действительно производить непрерывную мощность, которую он рекламирует.Формула для этого состоит в том, чтобы умножить ватты на 2, а затем разделить на автомобильный аккумулятор.

Например, если усилитель выдает 250 ватт, вы сначала умножаете это на 2 – количество получаемых ватт. Затем вы делите это на напряжение автомобильного аккумулятора, обычно 14,4 вольт. Это дает вам 35 ампер. Если в усилителе не используются предохранители с номиналом не менее 35 ампер, усилитель не сможет постоянно выдавать все 250 Вт.

Совместимость головного устройства с усилителем

Что касается входных штекеров, большинство штатных головных устройств не имеют выходов предусилителя (RCA).Если усилитель может принимать сигнал уровня динамика, приемник не имеет значения.

Однако, если усилитель может принимать только сигнал предусилителя, то в головное устройство потребуется добавить преобразователь линейного выхода (LOC).

Затем LOC преобразует выходной сигнал уровня динамика в сигнал уровня предусилителя RCA. Это позволяет подключить стереосистему к усилителю, а также ее можно использовать для подключения новой стереосистемы к штатному автомобильному усилителю.

Класс усилителя

Это относится к «топологии» архитектуры усилителя.Хотя технически существует 4 типа топологии усилителя, в автомобильных аудиосистемах чаще всего встречаются два: класса AB и D.

Класс AB имеет тенденцию обеспечивать лучшее качество звука . Однако даже многие аудиофилы признают, что разница, как правило, незначительна, если вы даже можете ее выделить. Эта топология также выделяет гораздо больше тепла, чем D-класс.

Для топологии класса D воспроизведение высоких частот технически хуже, хотя регистры обычно находятся вне пределов значимого различия. D Class намного более энергоэффективен и выделяет меньше тепла, чем AB Class .

Разница между высокочастотными регистрами классов AB и D, возможно, когда-то была более выраженной, но в современных усилителях это обычно считается минимальной разницей. Однако потребление энергии и тепловая мощность остаются большой разницей.

Качество звука

Есть несколько функций и факторов, которые в конечном итоге повлияют на наилучшее качество звука, которое может обеспечить ваш усилитель.Некоторые из них включают фильтры, частотную характеристику, чувствительность, отношение звука к шуму и полное гармоническое искажение (THD).

Все это влияет на различные качества звукового ландшафта, и в зависимости от того, что вы слушаете, некоторые из них будут более важными, чем другие.

Фильтры – Используется 3 фильтра, два из которых есть в большинстве приличных усилителей, а один – немного специализированный. Два фильтра, присутствующие в большинстве усилителей, – это фильтр высоких и низких частот.

И наоборот, затухание высоких частот (HPF) будет отфильтровывать более высокочастотные сигналы и отправлять их только на динамики, предназначенные для воспроизведения регистров более высоких частот – обычно на высокочастотные и супервычисляющие динамики.

Частотная характеристика – Это качество определяет максимальный диапазон частотных сигналов, которые может выдавать усилитель. Чем выше число, тем шире звуковой ландшафт. Однако частотная характеристика может немного вводить в заблуждение, поскольку многие из самых высоких и самых низких частот не слышны человеческому уху, которое находится в диапазоне от 20 Гц до 20 кГц.

Когда частота становится слишком низкой, она переходит в стадию субгармоники, хотя эти частоты часто все еще можно почувствовать, но не услышать. Точно так же, когда частота становится слишком высокой, она входит в фазу супергармоники, но эти частоты обычно не только не слышны, но и не ощущаются.

THD – Общее гармоническое искажение определяет, насколько точно усилитель воспроизводит входной сигнал, когда он проталкивает его к динамикам. Чем ниже это значение, тем лучше.

По сути, когда сигнал достигает усилителя и декодируется, чтобы затем передаваться с более высокой мощностью на динамики, сигнал может модулироваться и искажаться.

Лучшие усилители будут иметь самый низкий коэффициент нелинейных искажений и более точно воспроизводить сигнал при более высоких значениях мощности. Остерегайтесь усилителей с THD выше 3 процентов, так как вы начнете замечать разницу в качестве звука, и фактические звуки будут отличаться от более качественной системы.

Отношение звука к шуму или S / N – это величина, определяющая, сколько «шума» или помех сигнал переносит через усилитель, и измеряется в децибелах. Чем выше это число, тем лучше.

Размер

Старые усилители часто представляли собой большие тяжелые плиты, которые выделяли много тепла и нуждались в большом открытом пространстве для его рассеивания.По мере развития технологий компании начали производить более компактные усилители, которые можно разместить как в небольших, так и в меньших помещениях.

Однако это не мешает усилителю по-прежнему выделять значительное количество тепла. Таким образом, размер усилителя будет ограничивать и определять, где вы можете его разместить. Усилители меньшего размера часто можно разместить под сиденьем, и при этом они будут иметь доступ к достаточному потоку воздуха, чтобы оставаться в равновесии.

Получение лучшего 4-канального усилителя для вас

Лучшие 4-канальные усилители на рынке всегда вызывают споры, и нет научных доказательств, подтверждающих это.Однако, если у вас есть располагаемый доход, вам действительно некуда идти, кроме Alpine X-A70F.

Но, конечно, это очень дорого, и если вы не можете так сильно растягивать бюджет, стоит обратить внимание на другие усилители в каждой нише.

Если вы хотите получить что-то по достоинству во всех отношениях, Kicker CXA300.4 – отличный усилитель, обладающий широким диапазоном универсальности, чтобы соответствовать большему количеству конфигураций, чем большинство других.

Если вы собираетесь использовать усилитель для динамиков и усилитель для сабвуфера – что я настоятельно рекомендую – тогда вам следует поискать JL Audio JD400 / 4.Конечно, если вы хотите, чтобы один усилитель управлял ими всеми без ущерба для банка, вы не ошибетесь с Alpine MRV-F300.

Как бы то ни было, в списке есть усилитель, который может удовлетворить ваши потребности, независимо от того, что вы ищете. А с помощью моего подробного руководства для покупателя теперь вы сможете сделать более осознанный выбор для следующего обновления.

Какие бы 4-канальные вы ни выбрали и по какой-либо причине, я уверен, что они улучшат каждую вашу поездку. Веселиться.

Вернуться к таблице усилителей

Вклады Chl a в общую биомассу Chl a и…

Контекст 1

… две станции временного ряда SEATS (рис. 5a и c) и J4 (рис. 5c и d), вертикальное распределение температуры и солености в столбе морской воды было стабильно во времени. водный слой на станции K2 и самый высокий в поверхностном слое станции A9, ближайший к расходу реки Чжуцзян (рис. 6а). Концентрация Хл а в прибрежной зоне была намного выше, чем в прибрежной зоне. …

Контекст 2

…. взвешенная по глубине концентрация Chl a варьировала от 0,145 до 1,007 мкг / л (0,321 ± 0,250 мкг / л). Вклады различных фракций Chl a показаны на рис. 6а, б. …

Контекст 3

… соответственно. В нашем исследовании изучение фракционированного по размеру Chl a показало, что вклад пикопланктона в общую биомассу Chl a, как для поверхностного слоя (рис. 6a), так и для взвешенного по глубине водного столба (рис. 6b), увеличивался по сравнению с прибрежной зоной. области к пелагическим регионам. …

Контекст 4

… соответственно. В нашем исследовании изучение фракционированного по размеру Chl a показало, что вклад пикопланктона в общую биомассу Chl a, как для поверхностного слоя (рис. 6a), так и для взвешенного по глубине водного столба (рис. 6b), увеличивался по сравнению с прибрежной зоной. области к пелагическим регионам. …

Контекст 5

… наше исследование, посвященное изучению фракционированного по размерам Chl a, показало, что вклад пикопланктона в общую биомассу Chl a как для поверхностного слоя (рис. 6a), так и для глубинного слоя взвешенный столб воды (рис.6б), увеличилась от прибрежной зоны к пелагиали. Вероятно, это вызвано различными концентрациями питательных веществ в разных регионах: концентрации макроэлементов (таких как нитраты и фосфаты, см. Рис. 6c) в целом были ниже в прибрежных районах по сравнению с прибрежными водами. …

Контекст 6

… влияние отдельных факторов окружающей среды невозможно разделить статистически (Agawin et al., 2000; Qiu et al., 2010). Распределение биогенных элементов в поверхностном слое на всех станциях показано на рис.6c. Относительно низкие концентрации наблюдались на океанских станциях. …

Контекст 7

… на океанских станциях наблюдались низкие концентрации. Однако модели взвешенных по глубине значений концентраций биогенных веществ различались (рис. 6d), причем меньшие различия наблюдались между прибрежными и прибрежными станциями. …

Размер усеченной фотосистемы антенны хлорофилла у зеленой микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii при делеции гена TLA3-CpSRP43 | Физиология растений

” data-legacy-id=”s1″> РЕЗУЛЬТАТЫ

” data-legacy-id=”tblI”> Содержание хлорофилла и каротиноидного пигмента в фемтомолях (фмоль) и соотношения для дикого типа, мутанта tla3 и штаммов C. reinhardtii, комплементированных по tla3 (n = 3–5; Показанные значения являются средними ± SD)

Для исследования функциональных свойств фотосинтетического аппарата мутанта tla3 по сравнению с таковым у дикого типа была измерена кривая светонасыщения фотосинтеза в условиях in vivo с фотоавтотрофно выращенными клетками (рис.2). В расчете на один Chl скорость дыхания клеток в темноте, измеренная при 0 интенсивности света, составляла приблизительно 30 ммоль кислорода (моль Chl) ^-1 с ^-1 у дикого типа и 62 ммоль кислорода (моль Chl). ^-1 s ^-1 в мутанте tla3 (таблица II).

Рисунок 2.

Кривые светонасыщения фотосинтеза, полученные с диким типом C. reinhardtii (закрашенные квадраты) и мутантом tla3 (светлые кружки).Начальные наклоны обеих кривых схожи, что свидетельствует об одинаковом квантовом выходе фотосинтеза. Светонасыщенное Pmax было в 2 раза выше у мутанта tla3 , чем у дикого типа, что свидетельствует о большей продуктивности на основе Chl в tla3 , чем в диком типе.

Рисунок 2.

Кривые светонасыщения фотосинтеза, полученные с диким типом C. reinhardtii (закрашенные квадраты) и мутантом tla3 (светлые кружки). Начальные наклоны обеих кривых схожи, что свидетельствует об одинаковом квантовом выходе фотосинтеза.Светонасыщенное Pmax было в 2 раза выше у мутанта tla3 , чем у дикого типа, что свидетельствует о большей продуктивности на основе Chl в tla3 , чем в диком типе.

” data-legacy-id=”s4″> Анализ фланкирующих последовательностей вставки плазмиды в мутант tla3

Саузерн-блот-анализ геномной ДНК tla3 показал, что одна плазмида pJD67 была вставлена ​​в геномную ДНК мутанта tla3 (дополнительный рис.S1). Для клонирования фланкирующей последовательности вставки структуру и целостность вставленной плазмиды картировали с помощью ПЦР с точностью до 100 п.н. (дополнительный рисунок S2). Этот анализ выявил точку разрыва в плазмиде pJD67, которая произошла от 650 до 750 п.н. в пределах промотора гена ARG7 . На основании вышеизложенных данных была применена ПЦР с термической асимметричной переплетением (TAIL) с начальной точкой, расположенной примерно на 100 п.н. выше точки разрыва в промоторе ARG7 встроенной плазмиды.В этом подходе ожидается смесь двух продуктов, один из эндогенного промотора ARG7 и один из последовательности pJD67. После клонирования продуктов ПЦР в Escherichia coli секвенировали 50 клонов, чтобы определить, содержит ли какой-либо из них последовательность геномной ДНК C. reinhardtii , фланкирующую вставку pJD67. Однако все секвенированные клоны содержали исключительно последовательности, фланкирующие эндогенный промотор ARG7 , но не промотор вставки. Этот отрицательный результат можно объяснить большей эффективностью амплификации фланкирующей последовательности эндогенного промотора ARG7 , но не вставки.Чтобы увеличить шансы клонирования фланкирующей последовательности сайта встраивания плазмиды, использовали метод адаптера ДНК (дополнительный рисунок S3). Таким образом, сайт вставки был локализован на хромосоме 4, находясь в четвертом интроне предсказанного гена g5046 (рис. 5). ПЦР-анализ использовался для скрининга сайта вставки на предмет возможных делеций. Этот анализ показал, что предсказанный ген, расположенный непосредственно выше, а именно g5047, был удален в мутанте tla3 . Биоинформатический анализ показал, что предсказанный ген g5047 имеет гомологию с геном CpSRP43 у высших растений.Точно так же гену g5046 предположительно были приписаны окислительно-восстановительные свойства и он мог участвовать в окислительно-восстановительном гомеостазе клетки.

Рисунок 5.

Карта сайта вставки в геномной ДНК мутанта tla3 . Серые области удалены в мутанте tla3 , включая гомолог g5047 CrCpSRP43 и часть гена g5046. [Цветную версию этого рисунка см. В статье в Интернете.]

Рис. 5.

Карта сайта вставки в геномной ДНК мутанта tla3 .Серые области удалены в мутанте tla3 , включая гомолог g5047 CrCpSRP43 и часть гена g5046. [Цветную версию этого рисунка см. В статье в Интернете.]

” data-legacy-id=”s6″> ОБСУЖДЕНИЕ

Частица распознавания сигнала хлоропластов (SRP) определяется как совокупность четырех белков, которые работают вместе: CpSRP54, CpSRP43, CpFTSY и ALB3 (Aldridge et al., 2009). Постулируется, что белки-компоненты CpSRP участвуют в правильном сворачивании светособирающих белков и нацеливании этих белков на тилакоидную мембрану, тем самым облегчая биогенез и сборку голокомплексов фотосистемы (Pilgrim et al., 1998; Klimyuk et al., 1999). Во временной последовательности событий постулируется, что CpSRP43 в первую очередь и CpSRP54 во вторую очередь действуют в строме хлоропластов, где они связываются с гидрофобными доменами импортированных белков LHC, тем самым предотвращая их неправильную укладку и / или осаждение из водной фазы. Белок рецептора CpFTSY распознает белковый комплекс CpSRP54-CpSRP43-LHC и направляет комплекс к интегральному белку тилакоидной мембраны ALB3. Последний облегчает включение трансмембранных доменов белка LHC в тилакоидную мембрану.На основании анализа последовательности ДНК предсказано, что белки CpSRP43 и CpSRP54, являющиеся частицами распознавания сигнала хлоропластов, существуют в зеленых водорослях, но они еще не были подтверждены экспериментально или их функция не определена. Соответствующий рецепторный белок CpFTSY был недавно идентифицирован в C. reinhardtii и определен его уникальный эффект на сборку светособирающего комплекса Chl a / b (Kirst et al., 2012).

Эта работа показала, что локус tla3 у C.reinhardtii кодирует локализованный в хлоропласте светособирающий шаперонный белок, известный как CpSRP43. Эта аннотация для локуса tla3 была основана на успешной комплементации мутанта tla3 с конструкцией кДНК гена CrCpSRP43 . Эта работа, насколько нам известно, впервые предоставляет экспериментальные доказательства присутствия и функциональной роли белка CpSRP43 в зеленых микроводорослях. Белок CpSRP43 из C. reinhardtii имеет идентичность последовательности 27.6% и сходство 38,3% с белком AtCpSRP43 арабидопсиса. Несмотря на то, что эти числа относительно высоки, фенотип CpSRP43-нулевого мутанта различается между C. reinhardtii и Arabidopsis, по крайней мере, с точки зрения накопления пигментов в хлоропласте. Содержание Хл в C. reinhardtii упало примерно до 15% от содержания Хл в диком типе, в то время как Arabidopsis сохранил 50% своего содержания Хл (Amin et al., 1999; Klimyuk et al., 1999). Следовательно, мутация CpSRP43-null у микроводорослей, по-видимому, более серьезно влияет на сборку светособирающих белков, которые почти отсутствуют у мутанта tla3 , в то время как их численность не так сильно сказывается у соответствующего мутанта Arabidopsis. (Амин и др., 1999; Климюк и др., 1999).

Белок CrCpSRP43 имеет конфигурацию домена, аналогичную конфигурации домена белка AtCpSRP43. Оба белка содержат домен анкиринового повтора и три хромодомена, один перед анкириновым доменом и два сразу после него. Анкириновые повторы являются одними из наиболее распространенных белковых мотивов и участвуют во взаимодействиях белок-белок (Mosavi et al., 2004). Повторы анкирина ответственны за связывание мотива L18 светособирающих апопротеинов (DeLille et al., 2000; Tu et al., 2000; Stengel et al., 2008), тем самым предотвращая неправильную укладку или преципитацию гидрофобных апопротеинов LHCB и LHCA в фазе стромы (Falk and Sinning, 2010). Денатурация белков LHC была бы вероятным результатом в отсутствие этого молекулярного шаперона и могла бы происходить, поскольку возникающие апопротеины LHCB и LHCA импортируются в водную фазу стромы хлоропласта. Хромодомены обычно обнаруживаются в белках, которые функционируют, чтобы манипулировать или ремоделировать хроматин.Однако Goforth et al. (2004) и Funke et al. (2005) показали, что CD2 участвует в связывании CpSRP43 с CpSRP54 с образованием частицы распознавания сигнала. Из-за высокого сходства белков AtCpSRP43 и CrCpSRP43 и их сходной доменной структуры можно сделать вывод, что они выполняют сходные функции.

Интересно, что скорости клеточного дыхания у мутанта tla3 были существенно ниже, в расчете на клетку, примерно до 30% от показателей, измеренных у дикого типа.Усеченная антенна Chl в фотосинтетическом аппарате не должна априори влиять на способность клетки к дыханию (Polle et al., 2000, 2003). Скорее, потеря приспособленности к дыханию у мутанта tla3 может быть отнесена к потере или модификации генов, фланкирующих сайт (ы) вставки pJD67 в геномной ДНК (Kirst et al., 2012). Нельзя исключить возможность того, что один из затронутых генов в мутанте tla3 отрицательно повлиял на свойства дыхания, содержание PSII и PSI и / или размер клеток.Эти аномалии могут способствовать замедлению клеточного дыхания. Дополнительное соображение заключается в том, что штаммы tla , по необходимости из-за их пониженной способности поглощать достаточно света, не могут генерировать фотосинтат в достаточных количествах, чтобы насытить частоту дыхания клеток, тем самым ослабляя дыхательную способность мутантов.

Более низкое содержание фотосистемы tla3 по сравнению с диким типом является показателем общего развития мембраны нижних тилакоидов и изобилия в хлоропластах мутантов.Неспособность собрать импортированные светособирающие белки в этих мутантах tla может вызвать ингибирование по обратной связи в светособирающем белке и биосинтезе Chl, косвенно влияя на снабжение Chl и снижая способность хлоропластов собирать полный набор единиц PSII и PSI. Другое возможное соображение заключается в том, что дефицит светособирающих белков мог отрицательно влиять на морфологию тилакоидов. Было высказано предположение, что светособирающие белки необходимы для формирования стэков грана в прижатых тилакоидных мембранах (для обзора см. Allen and Forsberg, 2001).Отсутствие светособирающих белков у мутантов tla3 д., Таким образом, предотвращать стэкинг гран, существенно снижая площадь поверхности тилакоидной мембраны, в которую может быть помещен ФСII. Количество PSI, как следствие, отрицательно корректируется для удовлетворения потребностей хлоропласта с точки зрения эффективного и скоординированного транспорта электронов через мембраны тилакоидов.

Несмотря на полное отсутствие CpSRP43, мутант tla3 сохранял некоторую активность сборки LHC для внутренних светособирающих белков фотосистемы.Возможно, что одного CpSRP54 достаточно для образования комплекса с импортированными апопротеинами LHC и дальнейшего взаимодействия с транслоказой CpFTSY и ALB3 (Tzvetkova-Chevolleau et al., 2007; Bals et al., 2010), что объясняет наблюдение, что некоторые легкие – белки собирающей антенны включены в тилакоидную мембрану штамма tla3 , хотя и с гораздо меньшей эффективностью. В этом отношении Moore et al. (2003) показали, что CpSRP43 не требуется для взаимодействия CpSRP54-CpFTSY с белком инсертазы ALB3.Это наблюдение может объяснить, как некоторые светособирающие комплексы интегрируются в тилакоидную мембрану.

Важным моментом является домен тилакоидной мембраны, в котором происходит такая сборка. Мы предполагаем, что комплекс CpSRP специфически локализован и функционирует в «полярных» регионах хлоропласта, где происходит биогенез тилакоидной мембраны. Это предположение основано на наблюдении, что комплексы фотосистем и их размер антенны не могут быть изменены после того, как сборка произошла и когда трансмембранные комплексы становятся компонентами развитой тилакоидной мембраны (Melis, 1991; Kim et al., 1993). Согласно этой концепции, именно в полярных областях хлоропласта происходит одновременная сборка фотосистем, размер их антенн и формирование тилакоидной мембраны. Возникающая тилакоидная мембрана получает через белок ALB3 комплекс CpSRP43-CpSRP54-CpFTSY-LHC и направляет трансмембранные домены LHC в развивающемся липидном бислое тилакоидной мембраны. После гидролиза GTP белок LHC интегрируется в тилакоидную мембрану (Tu et al., 1999).Белки CpSRP CpSRP54 и ALB3, по-видимому, необходимы для правильной интеграции др. Трансмембранных белков, что очевидно из плейотропного фенотипа, генерируемого у соответствующих нокаут-мутантов (Amin et al., 1999; Bellafiore et al., 2002).

” data-legacy-id=”s8″> Культивирование клеток

Chlamydomonas reinhardtii штаммов CC-503 cw92 mt +, CC-425 arg2 cw15 sr-u-2-60 mt + и CC-125 дикого типа mt + 137C, полученные из Центра хламидомонады (http: // www.хлами. 1 ). Освещенность обеспечивалась сбалансированными люминесцентными лампами холодно-белого и теплого белого цветов. Клетки выращивали фотогетеротрофно в трис-ацетат-фосфатной среде (Gorman and Levine, 1965) или фотоавтотрофно в среде с высоким содержанием соли (Harris, 1989) при комбинации холодно-белого, теплого-белого флуоресцентного излучения и излучения лампы накаливания при интенсивности света 450 мкмоль фотоны м ⁻² с ⁻¹ .Для физиологических измерений культуры собирали во время фазы логарифмического роста (приблизительно 1–3 × 10 ⁶ клеток на мл ^-1 ).

” data-legacy-id=”s10″> Протоколы мутагенеза и скрининга

Мутанты C. reinhardtii были получены в результате инсерционного мутагенеза ДНК и трансформации плазмидной ДНК методом стеклянных шариков, как описано у Debuchy et al.(1989). Родительский штамм CC-425, ауксотроф Arg, был трансформирован 1 мкг Hin dIII-линеаризованной плазмиды pJD67, содержащей структурный ген ( ARG7 ) аргининосукцинатлиазы, чтобы дополнить Arg-требующий фенотип CC-425. штамм (Davies et al., 1996). Штамм CC-503 дикого типа трансформировали 0,5 мкг линеаризованной плазмиды pBC1 Kpn I (подарок из лаборатории доктора Криса Нийоги), придающей устойчивость к паромомицину. Трансформанты отбирали на среде, содержащей только трис-ацетат фосфат, и первоначально подвергали скринингу при измерении соотношения штаммов Chl – / b , после экстракции Chl 80% ацетоном.В этих измерениях использовался спектрофотометр BioTek Epoch, оснащенный считывателем 96-луночных планшетов.

” data-legacy-id=”s12″> Саузерн-блот анализ

Примерно 5 мкг геномной ДНК было переварено различными рестрикционными ферментами (New England Biolabs) в объеме 500 мкл при 37 ° C с инкубацией в течение ночи (16 ч).Расщепленную ДНК осаждали изопропанолом, промывали в 70% этаноле и ресуспендировали в 20 мкл буфера, содержащего 5 мМ Трис, pH 8,0. Фрагменты ДНК разделяли на 0,6% агарозном геле, переносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану (Hybond-N ⁺ ; Amersham) и сшивали в УФ-свете. Зонды получали с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров (дополнительная таблица S1) и плазмиды pJD67 в качестве ДНК-матрицы и метили щелочной фосфатазой с использованием набора Gene Images AlkPhos Direct Labeling and Detection System (Amersham).Протокол производителя использовался для мечения, гибридизации, отмывки и обнаружения сигнала со следующими модификациями: температура гибридизации и температура первичного промывочного буфера поддерживались на уровне 72 ° C.

” data-legacy-id=”s14″> Изоляция тилакоидных мембран

Клетки собирали центрифугированием при 1000 g в течение 3 минут при 4 ° C. Образцы ресуспендировали в ледяном буфере для обработки ультразвуком, содержащем 50 мМ трицина (pH 7,8), 10 мМ NaCl, 5 мМ MgCl ₂ , 0,2% поливинилпирролидона 40, 0,2% аскорбата натрия, 1 мМ аминокапроновой кислоты, 1 мМ аминобензамидина и 100 мкМ. мкм фенилметилсульфонилфторид. Клетки разрушали обработкой ультразвуком в Branson 250 Cell Disrupter, работающем при 4 ° C трижды по 30 с каждый раз (импульсный режим, рабочий цикл 50%, выходная мощность 5) с 30-секундными интервалами охлаждения на льду.Неразрушенные клетки и зерна крахмала удаляли центрифугированием при 3000 g в течение 4 минут при 4 ° C. Тилакоидные мембраны собирали центрифугированием первого супернатанта при 75000 g в течение 30 минут при 4 ° C. Осадок тилакоидной мембраны ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ трицина (pH 7,8), 10 мМ NaCl и 5 мМ MgCl ₂ для спектрофотометрических измерений или 250 мМ трис-HCl (pH 6,8), 20% глицерина, 7% SDS. и 2 м мочевины для анализа на белок.

” data-legacy-id=”s16″> 5 ‘и 3’ анализ RACE

Тотальную РНК выделяли из клеток CC-503 на ранней логарифмической фазе роста (0,5 × 10 ⁶ клеток, мл ^-1 ) с использованием реагента Trizol (Invitrogen). Геномная ДНК в этих образцах была расщеплена в соответствии с протоколом, предоставленным набором Turbo DNA-free (Ambion).5 ‘и 3’ RACE-анализы были выполнены с помощью набора FirstChoice RLM-RACE (Ambion) с использованием праймеров, как указано (дополнительная таблица S1). Протокол производителя соблюдался во всех процедурах.

” data-legacy-id=”s18″> Анализ геномной ДНК, фланкирующей сайт вставки плазмиды

В попытке изолировать C. reinhardtii геномную ДНК, фланкирующую сайт встраивания плазмиды, был использован протокол TAIL-PCR (Liu et al., 1995), оптимизированный для геномной ДНК C. reinhardtii , как недавно описано (Dent et al., 2005). Праймеры, используемые для TAIL-PCR, перечислены в дополнительной таблице S1. Вкратце, фланкирующую геномную ДНК амплифицировали с помощью ПЦР из области, прилегающей к вставленной плазмиде pJD67, которую использовали для инсерционного мутагенеза ДНК. Были разработаны специальные праймеры для первичных, вторичных и третичных реакций (дополнительная таблица S1). Два произвольных вырожденных праймера были протестированы на амплификацию, HK030 и HK031, как описано ранее (Dent et al., 2005). Общий протокол TAIL-PCR Liu et al. (1995) был использован с небольшими модификациями для различных реакций ПЦР-амплификации. Нуклеотидные последовательности полученных продуктов ПЦР получали с помощью анализатора последовательностей ABI3100. Метод адаптера был использован для выделения геномной ДНК C. reinhardtii , фланкирующей вставку плазмиды. tla3 расщепляли с помощью Xma I (New England Biolabs), и фрагменты размером от 3 до 5 т.п.н. очищали после гель-электрофореза с использованием набора для экстракции геля QIAquick (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя.Адаптер (дополнительные данные S1) лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 (New England Biolabs). Вложенную ПЦР (дополнительные данные S1) использовали для специфической амплификации последовательности, фланкирующей вставку плазмиды. C. reinhardtii Информация о последовательности геномной ДНК была получена с веб-сайта проекта генома хламидомонады: http://phyto5.phytozome.net/chlamy.php.

” data-legacy-id=”s20″> Дополнительные данные

В онлайн-версии статьи доступны следующие материалы.

• Дополнительный рисунок S1. Саузерн-блот-анализ для определения числа копий и целостности вставленной плазмиды pJD67 в геномную ДНК инсерционного трансформанта tla3 C. reinhardtii .

• Дополнительный рисунок S2. ПЦР-анализ геномной ДНК для картирования сайта встраивания плазмиды в геномную ДНК tla3 .

• Дополнительный рисунок S3. Стратегия клонирования последовательности геномной ДНК, фланкирующей сайт инсерции tla3 , с использованием метода адаптера.

• Дополнительная таблица S1. Праймеры, использованные в данной работе

• Дополнительные данные S1. Анализ фланкирующей последовательности вставки в мутант tla3.

“> Глоссарий

• Chl

• TAIL

  термически асимметричный переплетенный

• кДНК

• амол

Заметки автора

© 2012 Американское общество биологов растений. Все права защищены.

© Автор (ы) 2012. Опубликовано Oxford University Press от имени Американского общества биологов растений.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинальная работа правильно процитировано.

BLOCH Таблицы размеров для Великобритании

ДАМЫ

BLOCH предназначена только для ознакомления.Форма стопы, ширина и длина пальцев могут изменить то, как обувь подойдет каждому человеку. Все рекомендации по размеру основаны на стопе средней ширины. Для широкой стопы потребуется дополнительный размер вдвое больше рекомендуемого.

МУЖЧИНЫ

BLOCH предназначена только для ознакомления.